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  Kurs D Matrikelnummer : 10006882 10005802 Mikrobiologie I - WS 2016/17  Studiengang : B. Sc. Life Science (1.Semester)  Name, Vorname : Djuari, Michelle Angelica Irianto, Teresa Tamara Matrikelnummer : 10006882 10005802 PROTOKOLLBOGEN   V1 Direkte Isolierung von Mikroorganismen   Welche Erwartungen bezüglich der mikrobiologischen Qualität hatten Sie bei der Wahl des Entnahmeorts Ihrer mitgebrachten Probe? Welche bei der Wahl des Luftexpositionsstandorts? Präsentieren Sie Ihre Ergebnisse tabellarisch (Parameter: Keime pro g Erde (Medienart); pro mL Wasser, pro h Exposition und Inkubationstemperatur). Welchen Einfluss haben Medienart und Inkubationstemperatur, begründen Sie! Stimmen Ihre Erwartungen mit den erzielten Ergebnissen überein? Diskutieren Sie Ihre Ergebnisse! Erwartungen Erdprobe : Probe aus Garten. Wir erwarten eine vielfaltig hohe mikrobielle Aktivität Wasser : Probe aus Studentenwohnheim (Leitungswasser). Es sollte relativ niedrige mikrobielle Aktivität vorkommen, da es als Trinkwasser benutzt wird. Luft : 2 Agarplatten werden unter der Toilette gelegt. Wir erwarten viele Mikroorganismen wegen der hohen Feuchtigkeit in der Umgebung. Das ist eine optimale Bedingung fürs Wachstum der Mikroorganismen. Ergebnisse Erdprobe Medium Verdünnung Temperatur Keime pro g Erde 1 NB 10 - 37°C 1,1*10 2 NB 10 -  37°C 2*10 3 HA 10 -  27°C 3*10 4 nHA 10 -  27°C 9*10 Wasserprobe Keime pro ml H 2 O 1 NB 10 -  27°C >2*10   2 NB 10 -   27°C 1,4*10   3 NB 10 -  27°C 6*10   4 NB 10 -  27°C 1,9*10   Luftprobe Keime pro h Exposition 1 NB - 27°C 36 2 NB - 37°C 38  Kurs D Matrikelnummer : 10006882 10005802 Einfluss der Medien: Jede Medienart hat spezifische Eigenschaften, mit denen man  bestimmte Bakterien bzw. Mikroorganismen selektieren kann. Mikroorganismen können nur unter bestimmten Umweltbedingungen leben. Nur Mikroorganismen unter den bestimmten Eigenschaften für ein bestimmtes Medium, können auf diesem Medium überleben und wachsen. Einfluss der Inkubationstemperatur: Mikroorganismen haben ein bestimmtes Temperaturoptimum, bei dem sie optimal wachsen. Mit der Inkubationstemperatur kann man unerwünschte Mikroorganismen eliminieren, und das Wachstum der erwünschten fördern. Bei der Erdprobe haben wir eine hohe mikrobielle Aktivität vermutet. In unseren Agarplatten konnten wir wenige Mikroorganismen beobachten. Bei der Wasserprobe haben wir eine niedrige mikrobielle Aktivität erwartet, aber auf unseren Agarplatten leben sehr viele Mikroorganismen. Bei unserer Luftprobe haben wir vermutet, dass die Anzahl von Bakterien hoch wird. In unseren Agarplatten konnten wir wenigen Bakterienkolonien beobachten. Unsere Ergebnisse stimmen nicht mit unserer Vermutung überein. Die abweichende Anzahl von Bakterienkolonien kann von unserem Fehler beim Verdünnen stammen. V2 Selektive Anreicherungen von Mikroorganismen Beschreiben und begründen Sie die jeweiligen Schritte der 4 selektiven Anreicherungen. Anzahl der Kolonien? Erstellen Sie Zeichnungen der beobachteten Zellen! Welche Rolle spielt der gewählte Probenstandort? Worin entsprechen die Eigenschaften Ihrer Anreicherungskulturen den Eigenschaften, die für die Gattungen  Azotobacter,  Bacillus und Clostridium und die Familie der  Rhodospirillaceae im Brock oder anderen Lehrbüchern der Mikrobiologie beschrieben sind, worin unterscheiden sie sich? Mannit ist ein Minimalmedium, wobei Mannit als die einzige Kohlenstoffquelle ist und keine fixierte Form von Stickstoff enthält. Bei diesem Versuch wurde 0,1 ml Bodenprobensuspension (Verdünnung: 0,01) ausplattiert und für 3 Tage bei 27°C inkubiert. Mannit-Agar ist ein Selektionsmedium für Azotobacter. Azotobacter ist Stickstofffixierer, chemoheterotroph, Gram negativ und aerob. !  Ergebnis : 30 Kolonien Titer : 3*10 3  Stärke ermöglicht Wachstum von Mikroorganismen, die Stärke verstoffwechseln können. Bei diesem Versuch wurde Bodenprobensuspension 10 -1 und 10 -2  für 15 Minuten im Wasserbad bei 80°C pasteurisiert. Der Vorgang dient zur Abtötung vegetativer Zellen. Danach wurde jeweils 0,1 ml von den beiden Suspensionen  Kurs D Matrikelnummer : 10006882 10005802 ausplattiert und bei 37°C inkubiert. Einer Art von Bakterien, der mit Stärke wachsen kann, ist Bacillus. Bacillus ist Endosporenbildner, chemoheterotroph, Gram positiv und aerob. !  Ergebnis: 54 Kolonien bei der Verdünnung 10 -2 ; keine Kolonien bei der Verdünnung 10 -1 Titer: 5,4*10 3  Keime pro g Erde: 5,4*10 5  Anaerob ist Stoffwechsel unter anoxischen Bedingungen. Bei diesem Versuch wurde 1 ml der erhitzten Bodenprobensuspension 10 -1  in 10 ml Hefe-Extrakt Medium mit einem Durham Röhrchen überführt. Die Probe wurde dann in einem anaeroben Topf mit einem anaeroben Päckchen (damit der Sauerstoff fixiert wird) bei 27°C inkubiert. !  Ergebnis : ã   Keine Gasbildung !  wahrscheinlich keine Clostridien ã   Im unteren Teil weiße Ablagerung (Biomasse) Phototrophie ist die Nutzung von Licht als Energiequelle durch Lebewesen. In diesem Versuch wurde 5 ml der Wasserprobe in 45 ml Selektivmedium für phototrophe Bakterien pipettiert und bei 27°C unter Tageslichtlampen inkubiert. Dieses Selektivmedium enthält die Nährstoffe für Rhodospirillaceae (Purpurbacterien). Die Eigenschaften davon sind Stickstofffixierer, anaerob, fakultativ phototroph, Gram negativ. !  Ergebnis : ã   Starke Trübung ã   Keine farbgebenden Bakterien V3 Steriles Arbeiten, Stammhaltung Warum werden Einzelkolonien benötigt? War Ihr Einzelkolonieausstrich erfolgreich? Skizzieren Sie die Platte! Diskutieren Sie mögliche Schwachstellen. Wie erhalten Sie eine Reinkultur? Einzelkolonien wird benötigt zur Isolierung und Charakterisierung eines bestimmten Stammes von Mikroorganismen. Reinkultur kann durch Verdünnungsausstrich erhalten werden. Hier wird Zellmaterial auf 2 frischen Stärke-Agarplatten ausgestrichen. Die Schwachstellen könnten passieren, falls eine mikrobielle Kontamination aus der Luft oder von der Impföse gäbe. Ergebnis: unsere beide Platten sind erfolgreich (Kolonien sind darauf gewachsen)  Kurs D Matrikelnummer : 10006882 10005802 Wie war das Ergebnis beim Überimpfen auf das neue Schrägröhrchen? Wie häufig muss dieser Vorgang zur Stammerhaltung wiederholt werden? Was sind die limitierenden Parameter? Nennen Sie zwei weitere Stammerhaltungsformen. Bei unseren Schrägröhrchen sind Kolonien gewachsen. Dieser Vorgang muss alle 6-8 Wochen wiederholt werden bei Bakterien, bei Hefen muss der Vorgang alle 3 Monaten wiederholt werden. Die limitierenden Parameter sind die Nährstoffe im Agar, die die Bakterien verstoffwechseln können. Es gibt noch 2 weitere Stammerhaltungsformen, Lyophilisierung, wo die Bakterien gefriergetrocknet sind und Stammerhaltung in einer Glycerinkultur (bei -80°C gefriert) V9   Schreiben Sie ein Kurzprotokoll zur Herstellung einer Glycerinkultur, ausgehend von der gelieferten Kultur (auf festem Nährboden) bis hin zur Überprüfung der neu angelegten. Geben Sie auch benötigte Materialien an. Materialien: ã   Kultur von  E. coli  0,5 ml ã   LB + 30% Glycerin 0,5 ml ã   Gasbrenner ã   Impföse ã    NB Agarplatte ã    NB Medium (flüssig) Schritte: 1.   Impföse erhitzen/abflammen und Abstrich aus  E. coli  Stamm (fester  Nährboden) entnehmen 2.   Abstrich in 5 ml RG suspensieren und bei 37°C schüttelnd inkubieren 3.   0,5 ml daran mit 0,5 ml LB+30% Glycerin in einem Eppi cup und bei -20°C einfrieren (aber eigentlich muss es -80°C sein) 4.   Suspension mit sterilen Impföse auf NB Agarplatten ausstreichen und bei 37°C inkubieren 5.   Suspension mit sterilen Impföse in 5 ml LB flüssig suspensieren und bei 37°C inkubieren Ergebnis: unsere Glycerinkultur war erfolgreich. Man kann sowohl auf dem NB-Medium als auch im LB-Flüssigkeit das Wachstum von Kolonien sehen.
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